Wat is Luciferase?

Luciferase is een algemene naam voor een klasse enzymen die gewoonlijk in de natuur voor bioluminescentie zorgen. De naam is afgeleid van Lucifer, wat "licht-drager" betekent. Het bekendste voorbeeld is een luciferase van de glimworm Photinus pyralis.

Luciferase is een enzym dat wordt gebruikt voor bioluminescentie door verschillende organismen in de natuur, de beroemdste is de vuurvlieg. De wetenschapper produceert een construct waarin het regulerende gebied van een doelgen is gefuseerd met de DNA-coderende sequentie voor luciferase. De kleine omvang van luciferine maakt het ook tot een slecht antigeen en immuunreacties op luciferine zijn onwaarschijnlijk. Luciferine kan de bloed-hersenbarrière, de bloedplacentabarrière en de bloedtestis-barrière passeren, de toxiciteit lijkt laag.

P. Riggs, in Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition), 2013

Luciferasen zijn enzymen die licht produceren wanneer ze hun substraat oxideren. Het gen voor de meest voorkomende luciferase komt van de vuurvlieg, maar luciferasen van andere dieren zoals het viooltje Renilla reniformis, de roeipootkreeft Gaussia princeps en de ostracode Cypridina noctiluca worden ook als verslaggever gebruikt. Wanneer een luciferase is gefuseerd met een eiwit van belang, kan de expressie ervan zeer nauwkeurig worden gemeten met een luminometer. De vuurvliegluciferasereactie vereist zijn substraat luciferine, plus adenosinetrifosfaat (ATP), O2 en Mg2 +. De luciferasen van Renilla en Gaussia gebruiken coelenterazine als hun substraten; Cypridina gebruikt zijn eigen luciferine als substraat. Luciferasen worden vaak gebruikt om het expressieniveau van eiwitten waaraan ze zijn gefuseerd te rapporteren.

A. Kimura, E. Kobayashi, in Encyclopedia of Neuroscience, 2009

Luciferasen zijn een groep enzymen die licht uitzenden in aanwezigheid van zuurstof en een substraat (luciferine). Zo'n luciferine-luciferasesysteem wordt bijvoorbeeld in de natuur aangetroffen in bacteriën (Vibrio harveyi), dinoflagellaten (Gonycaulax) en de vuurvlieg (Photinus pyralis). Deze luciferasen, in het bijzonder het eukaryote vuurvliegluciferase (Luc), zijn algemeen gebruikt als een lichtprobe in een aantal biologische experimenten, waaronder promoteractiviteitstesten. Bovendien, dankzij recente vorderingen in videocamera's met hoge gevoeligheid voor het tellen van fotonen, hebben een aantal studies Luc gebruikt als een reportergen in real-time niet-invasieve in vivo beeldvorming. Deze in vivo beeldvorming maakt de visualisatie mogelijk van het ruimtelijke en temporele gedrag van cellen die Luc tot expressie brengen bij levende dieren; bijvoorbeeld groei van tumorcellen, handel in immuuncellen en migratie van getransplanteerde cellen. Deze beeldvormende onderzoeken met Luc-gelabelde cellen hebben nieuwe inzichten opgeleverd die niet konden worden verkregen met conventionele histologische benaderingen.

Hoe werkt Luciferas test?

Luciferase van vuurvliegjes is onstabiel in B. subtilis met een halfwaardetijd van slechts ∼ 6 minuten. De geschiktheid van GFPmut3 (halfwaardetijd van ∼ 10 uur) en vuurvliegluciferase (halfwaardetijd of ∼ 6 min) voor kinetische analyse met hoge resolutie van promotoractiviteit komt dus voort uit hun contrasterende stabiliteit in vivo.

Luciferasen zijn enzymen die een substraat genaamd luciferine gebruiken, samen met zuurstof en ATP, in een energetisch proces dat licht produceert - zoals de gele gloed van vuurvliegjes. De kracht van luciferase is door wetenschappers aangewend om reacties te bedenken waarvan de lichtopbrengst wordt gebruikt om biologische processen te volgen, waaronder genexpressie, biomoleculaire binding en levensvatbaarheid van cellen.
Hier zijn een paar toepassingsnotities over luciferase-assays om te helpen bij uw COVID-19-vaccinonderzoek.

Om een ​​luciferase-reportertest uit te voeren, hebt u een DNA-plasmide nodig om het eiwit tot expressie te brengen waarvan u denkt dat het de transcriptie kan beïnvloeden.
Je zult ook een ander DNA-plasmide moeten gebruiken met het regulerende element (of een doelpromotorregio) gefuseerd met de DNA-coderende sequentie voor een luciferase-enzym. Wanneer geactiveerd, produceert dit systeem luciferase.
Nadat cellen zijn getransfecteerd met het luciferase-reporterplasmide en enkele dagen hebben laten groeien, zijn de volgende stappen om de cellen te lyseren, een substraat aan het cellysaat toe te voegen en de luciferase-activiteit te meten op basis van de hoeveelheid bioluminescent signaal. Een Luciferase Reporter Assay. De luciferase-assay is nuttig om te onderzoeken of een eiwit van belang een bepaald gen op transcriptieniveau reguleert. Door transfectie komt een DNA-construct met de promotor van het gen en een coderend gebied van het luciferase-reportergen de cellen binnen. Een ander DNA-construct dat in de cellen wordt geïntroduceerd, bestaat uit een coderend gebied van het eiwit van belang. Wanneer dit eiwit transcriptie activeert, zal de cel luciferase-enzym produceren. Na toevoeging van een lysisbuffer en een substraat kwantificeert een luminometer de luciferase-activiteit.